近年來，實時熒光PCR技術(shù)在動物疫病診斷中的應(yīng)用得到了進一步的發(fā)展，在診斷動物的病毒性、細菌性和寄生蟲性疫病中得到了廣泛的應(yīng)用。實時熒光PCR不僅實現(xiàn)了常規(guī)PCR從定性到定量的飛躍，而且與常規(guī)PCR相比，實時熒光PCR技術(shù)由于多使用了一條可與模板互補配對的熒光探針，提高了特異性，并且由自動化儀器收集熒光信號，避免了肉眼判斷的主觀性，又可進一步提高靈敏度；實時熒光PCR技術(shù)全封閉反應(yīng)，無須PCR后處理，避免污染，了結(jié)果的可靠性和重復(fù)性。隨著實時熒光PCR試劑盒的進一步開發(fā)，實時熒光PCR技術(shù)將會在動物疫病診斷中得到更加廣泛的應(yīng)用。

實時熒光PCR技術(shù)是在常規(guī)PCR技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的核酸定量技術(shù)。實時熒光定量PCR技術(shù)于1996年由美國Applied Biosystems公司推出，它是一種在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團，利用熒光信號的積累實時監(jiān)測整個PCR進程，后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進行定量分析的方法。目前報道的熒光探針主要有Taqman，Amplisensor，分子標(biāo)信，Lightcyclor以及在這4種探針基礎(chǔ)上發(fā)展起來的熒光探針。該技術(shù)不僅實現(xiàn)了對DNA/RNA模板的定量，而且與常規(guī)的PCR相比，具有靈敏性和特異性高，能實現(xiàn)多重反應(yīng)、自動化程度高、無污染、實時和等特點。目前，已廣泛應(yīng)用于分子生物學(xué)和醫(yī)學(xué)研究等領(lǐng)域，特別是近幾年來在動物疫病的診斷中得到了廣泛的應(yīng)用。

1 診斷病毒病

1.1 禽流感

禽流感病毒變異極為頻繁，血清亞型眾多，已報道的有15種血凝素HA亞型（H1～H15）和9種神經(jīng)氨酸酶NA亞型（N1～N9）。禽流感病毒呈性分布，絕大多數(shù)禽流感病毒呈隱性感染，不表現(xiàn)臨床癥狀，只有少數(shù)禽流感病毒具有迅速傳播和高致病性的特性。外檢測禽流感病毒的方法是OIE的雞胚病毒分離方法，該方法約需要耗時21 d，不適合禽類進出口的檢疫和發(fā)生疫情時的及時診斷。張鶴曉等[1]根據(jù)A型流感病毒的核酸保守區(qū)共有序列，開發(fā)、設(shè)計多條引物和探針序列，從中篩選敏感、特異的引物和探針，在循環(huán)參數(shù)、病毒核酸的提取方法、反轉(zhuǎn)錄條件的基礎(chǔ)上，建立了快速的通用型“一步法”檢測所有A型流感病毒的通用型熒光RT-PCR。該方法與雞胚病毒分離相比，敏感性基本一致，可直接用來檢測泄殖腔、喉拭子和禽肉，將檢測時間從原來的21 d縮短為4 h。朱文斯等[2]根據(jù)禽流感病毒H5亞型的RNA 4節(jié)段設(shè)計了檢測禽流感病毒H5亞型的引物和探針，其敏感性高能達到10-7，該方法特異性強，與傳染性法氏囊病毒中等毒力及弱毒疫苗、新城疫弱毒疫苗、傳染性支氣管炎弱毒疫苗、鴨瘟弱毒疫苗、鴨病毒性肝炎弱毒疫苗及有可能感染的禽流感病毒H9亞型、新城疫強毒、雞傳染性貧血病毒均不反應(yīng)。 

1.2 新城疫

新城疫病毒屬于副黏病毒，根據(jù)毒株的致病力可分為強毒力型、中等毒力型及弱毒力型。OIE檢測新城疫病毒的方法是雞胚病毒分離方法，需要21 d。張鶴曉等[3]建立的熒光RT-PCR方法不僅能將中強毒力新城疫病毒與弱毒區(qū)分開來，而且不與常見的禽類病毒發(fā)生交叉反應(yīng)，其敏感性高可達10-7。楊德勝等[4]利用熒光RT-PCR方法對910份樣品進行新城疫病毒檢測，陽性30份，并用雞胚分離部分檢測樣品，結(jié)果一致。說明了熒光RT-PCR方法檢測新城疫病毒具有敏感、特異、快速、、安全等特點。

1.3 口蹄疫

口蹄疫是一種危害偶蹄動物的烈性傳染病，被OIE列為A類動物傳染病?？谔阋叩谋┌l(fā)曾經(jīng)給許多國家和地區(qū)的畜牧業(yè)及動物貿(mào)易帶來災(zāi)難性的損失。口蹄疫病毒屬于小RNA病毒科，為單股正鏈，血清型復(fù)雜多變，有7個血清型，即O、A、C、SAT1、SAT2、SAT3和Aasia1型。傳統(tǒng)的病毒分離鑒定方法耗時長，敏感性和性都較差，ELISA方法敏感性低，常規(guī)RT-PCR在樣品進行檢測的過程中容易被污染，以上方法難以適應(yīng)當(dāng)前口蹄疫防疫工作的要求。建立一種快速和可靠的診斷方法，對于控制和消滅口蹄疫至關(guān)重要?；ㄈ毫x等[5]根據(jù)口蹄疫病毒聚合酶3D基因片段非常保守的區(qū)域設(shè)計的引物、探針，擴增區(qū)內(nèi)口蹄疫病毒 O型、A型、C型、Asia1型、SAT1～3型的序列相同，引物和探針是通用的，建立了熒光RT-PCR方法，對細胞培養(yǎng)物、水皰液、水皰皮及分泌物進行了檢測，得到了滿意的結(jié)果，與其他水皰性病毒不發(fā)生交叉反應(yīng)。楊素等[6]應(yīng)用熒光RT-PCR技術(shù)，利用O型口蹄疫病毒的5′端UTR區(qū)的IRES片段設(shè)計和合成了可檢測7個血清型口蹄疫病毒群特異性引物和Taqman探針，結(jié)果表明敏感性高，特異性強，耗時僅為4 h，克服了傳統(tǒng)的病毒分離鑒定方法耗時長，敏感性和性較差，而且容易造成病毒擴散及環(huán)境污染的缺點，適用于大批量樣品的快速檢測。

1.4 豬瘟

對豬瘟病毒的傳統(tǒng)診斷方法包括免疫熒光試驗、細胞分離培養(yǎng)、酶聯(lián)免疫吸附試驗、動物接種試驗等，這些方法都存在不足之處。溫國元等[7]在豬瘟病毒高度保守的5′端非編碼區(qū)作為擴增靶區(qū)，設(shè)計了兩對引物和一條Taqman探針，建立了熒光RT-PCR方法，該方法的檢測靈敏度可達10拷貝/μL，對不同毒株以及各種組織樣品檢測結(jié)果均為陽性，該方法比RT-PCR靈敏度高100倍，與PCR具有相同的靈敏度。陳玉棟等[8]在豬瘟病毒兔化弱毒疫苗株的5′端非編碼區(qū)設(shè)計一對引物和一條熒光探針，結(jié)合Light Cycler檢測系統(tǒng)，建立了定量檢測豬瘟兔化弱毒疫苗的方法，該方法的靈敏度為100拷貝數(shù)，整個檢測過程僅需4 h，該方法可望取代傳統(tǒng)的兔體定型反應(yīng)用于疫苗生產(chǎn)過程中的效價測定及指導(dǎo)疫苗的配制，也為豬瘟病毒分子生物學(xué)研究提供了一種新的、簡捷有效的工具。

2 診斷細菌病

2.1 大腸埃希菌O157∶H7

大腸埃希菌O157∶H7是腸出血大腸埃希菌的一種主要血清型，可引起人出血性結(jié)腸炎、溶血性尿綜合征及血栓形成性血小板減少性紫癜等嚴重并發(fā)癥。該菌主要通過食物傳播，動物是其主要的宿主。近年來外各個實驗室診斷大腸埃希菌O157∶H7的檢測方法不斷出現(xiàn)，其中有PCR方法，多重PCR方法，但這些方法檢測時間比較長，檢測過程繁瑣，不適合大規(guī)模動物產(chǎn)品的檢測。Jothikumar N等[9]運用一種復(fù)合式Sybr Green實時熒光PCR方法快速測定大腸埃希菌O157∶H7，用一對特異引物同時擴增大腸埃希菌O157∶H7的類志賀毒素（stx1或stx2）基因。鑒于擴增后產(chǎn)生的兩個PCR產(chǎn)物的Tm值不等,由此加以區(qū)別。此方法操作簡便，快速，特異性好。張險朋等[10]應(yīng)用實時熒光PCR方法對大腸埃希菌O157∶H7菌株檢測為陽性，而大腸埃希菌O1∶H7，O119，O143及沙門菌無交叉反應(yīng)，證明應(yīng)用實時熒光PCR方法檢測大腸埃希菌O157∶H7的特異性強，快速，適用于動物產(chǎn)品快速檢測。

2.2 沙門菌

沙門菌的傳統(tǒng)鑒定方法是挑取單個菌落進行生化方面的試驗，而后利用血清凝集試驗進行分型，由于方法本身的特異性問題而使鑒定的性和靈敏度較差，而且耗費的時間。趙雪濤等[11]根據(jù)沙門菌GenBank Accession NO U25352基因序列,設(shè)計并合成引物和Taqman探針，將PCR擴增的沙門菌基因片段克隆導(dǎo)入載體,構(gòu)建的重組質(zhì)粒經(jīng)篩選、鑒定后,作為陽性模板,用于標(biāo)準(zhǔn)曲線的制定。利用熒光定量PCR技術(shù)進行各類菌株的定性鑒定。應(yīng)用重組質(zhì)粒制作的定量曲線,其循環(huán)閾值與模板濃度的對數(shù)值具有良好的線性關(guān)系,相關(guān)系數(shù)為0.999。檢測各類菌株,其中沙門菌41株、H抗原丟失的沙門菌16株均呈陽性;非沙門菌109株均呈陰性。證明建立的沙門菌的熒光定量PCR方法簡便、快速、。

2.3 炭疽芽孢桿菌

炭疽是由炭疽芽孢桿菌引起的人獸共患病，炭疽芽孢在環(huán)境中抵抗力*，在軍事上一直被列為*生物戰(zhàn)劑，快速檢驗和鑒定炭疽芽孢桿菌無論對人和草食動物炭疽病診斷，還是應(yīng)對可能出現(xiàn)的生物恐怖襲擊都十分重要。李偉等[12]采用實時熒光PCR技術(shù)，以pXO1質(zhì)粒上的pag基因、pXO2質(zhì)粒上的cap基因及染色體上的ropB基因設(shè)計引物和探針，應(yīng)用上述基因探針的外標(biāo)對照、pagA基因的內(nèi)標(biāo)對照等技術(shù)建立一種快速、、特異、定性、定量檢測炭疽芽孢桿菌的方法。陳蘇紅等[13]以pXO1質(zhì)粒上的pag基因及pXO2質(zhì)粒上的cap基因為靶合成特異引物,用DNA嵌入熒光染料SYBR GreenⅠ進行定量PCR擴增,在PCR后進行熔解曲線分析，以確定得到的產(chǎn)物是否為目的產(chǎn)物。該方法檢測炭疽芽孢桿菌的靈敏度達1 000拷貝。

2.4 胸膜肺炎放線桿菌

豬胸膜肺炎放線桿菌（APP）有2個生物亞型和15個血清型，傳統(tǒng)的檢測方法有血清學(xué)方法和常規(guī)PCR方法，均存在不足之處。李樹清等[14]根據(jù)APP apxⅣA毒素基因的序列設(shè)計了引物和探針，建立實時熒光PCR方法并初步應(yīng)用，在150份樣品中檢出APP陽性23份。

3 診斷寄生蟲病

王頻佳等[15]利用擴增的弓形蟲529 bp重復(fù)序列,經(jīng)TA克隆后轉(zhuǎn)化入大腸埃希菌DH5α中;提取重組質(zhì)粒鑒定后,作為模板建立熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線,并做重復(fù)性試驗和臨床標(biāo)本檢測，用重組質(zhì)粒制作的標(biāo)準(zhǔn)曲線循環(huán)閾值與模板濃度有良好的線性關(guān)系,相關(guān)系數(shù)為0.995,試驗間變異系數(shù)平均為3.28%,無非特異性擴增，樣品檢測陽性率為43.3%。建立了檢測弓形蟲基因的熒光定量方法,具有快速、靈敏、特異的特點。Woo T H等[16]以Light Cycler TM為平臺，利用SYBR GreenⅠ作為熒光染料，建立了一種鑒定鉤端螺旋體的實時 PCR方法,目標(biāo)片段為16S rRNA,利用熔點曲線分析來區(qū)別特異產(chǎn)物、引物二聚體和非特異性產(chǎn)物,不需要電泳來鑒定,該方法快速而敏感,整個過程在20 min內(nèi)完成。James A H等[17]用以ABIPrism7700SDS為平臺，應(yīng)用Taqman探針建立了從小牛腹瀉糞便中定量檢測小隱孢子蟲cp11基因和18S rRNA的實時熒光PCR方法。

4 展望

由于實時熒光定量PCR無需內(nèi)標(biāo)實時熒光定量，此技術(shù)有效地解決了傳統(tǒng)定量只能終點檢測的局限，實現(xiàn)了每一輪循環(huán)均檢測一次熒光信號的強度，并記錄在電腦軟件之中，通過對每個樣品Ct值的計算，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得定量結(jié)果。實時熒光定量PCR解決了雙重PCR反應(yīng)中存在兩種模板之間的干擾和競爭，尤其當(dāng)兩種模板的起始拷貝數(shù)相差比較大時，這種競爭會表現(xiàn)得更為顯著[18-19]。由于待測樣品的起始拷貝數(shù)是未知的，所以無法加入合適數(shù)量的已知模板作為內(nèi)標(biāo)。正是這個原因，傳統(tǒng)定量方法雖然加入內(nèi)標(biāo)，但仍然只是一種半定量的方法。美國Texas大學(xué)的科研人員經(jīng)反復(fù)實驗，其結(jié)論是，內(nèi)標(biāo)法作為定量或半定量的手段是不可靠的，而外標(biāo)準(zhǔn)曲線的定量方法是一種的、值得信賴的科學(xué)方法[20]。實時熒光PCR技術(shù)作為一種新的檢測技術(shù)已廣泛應(yīng)用于動物疫病的診斷。目前，在動物疫病的診斷上，現(xiàn)已發(fā)展到至少有15種實時熒光PCR方法。市場上也出現(xiàn)一些動物疫病診斷的實時熒光PCR試劑盒。雖然實時熒光PCR的檢測成本比較高，實時熒光PCR儀比較昂貴，但隨著實時熒光PCR技術(shù)的進一步普及和發(fā)展，實時熒光PCR試劑盒的進一步開發(fā)，以及它具有比傳統(tǒng)病原學(xué)、血清學(xué)和常規(guī)的PCR更敏感、特異、無污染等優(yōu)點，此技術(shù)將會在動物疫病診斷中得到更加廣泛的應(yīng)用。